灵龟八法开穴灸对阳虚模型大鼠外周血CD4CD8影响的实验研究：太阳成集团

目的：仔细观察灵龟八法进穴灸对阳虚模型大鼠外周血T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+的影响。方法：以醋酸泼尼松注射液（AHP）对大鼠展开肌肉注射以创建阳虚大鼠模型，较为运用灵龟八法进穴灸与穴位（足三里、肾俞）保守灸对模型大鼠外周血T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+变化的影响。

结果：灵龟八法进穴灸组和足三里、肾俞保守灸两组模型大鼠与长时间组大鼠外周血CD4+/CD8+比值变化无显著差异。结论：灵龟八法开穴灸法可以提升阳虚模型大鼠外周血T淋巴细胞免疫系统功能。

 【关键词】阳虚模型,灵龟八法，足三里，肾俞，T淋巴细胞亚群。   中医学指出，阳虚是指机体阳气稍衰微、正气严重不足，从而展现出出有一系列机能衰退，新陈代谢弱化的病理状态[1]。

研究表明免疫系统功能低落归属于阳虚的范畴。CD4+、CD8+是T淋巴细胞的亚群，其比值是体现免疫系统功能状况的最重要指标之一。大量临床实践指出灸法对化疗阳虚证有很好的疗效，而灵龟八法这种如期开穴的方法是中医学整体观念的最重要反映，能提升针灸临床疗效。本实验主要从灵龟八法开穴灸法的角度来探究灸法预防阳虚证的免疫学机理。

1 材料与方法1.1实验动物   搭配SD大鼠50只，230g～280g（SPF级，武汉大学动物实验中心获取，许可证号：SCXK(鄂）2008-0004），雌雄用为。1.2主要药品与试剂   醋酸泼尼松龙注射液（AHP)：125mg/5ml浙江仙琚制药股份有限公司（国药准字H33020824,生产批号120912）；艾灸条：南阳市绿佳艾绒厂；FITC（一硫氰酸荧光素）标记小鼠外用大鼠CD4单克隆抗体、PE（藻白蛋白）标记小鼠外用大鼠CD8单克隆抗体、APC（别藻蓝蛋白）标记小鼠外用大鼠CD3单克隆抗体：美国eBiscience公司产品；红细胞降解液，武汉谷歌生物科技有限公司产品，货号：G-2015；胰酶Trypsin，Amresco公司产品，货号：0457；0.9%氯化钠注射液；1%肝素钠注射液；自配PPS液等。1.3主要仪器设备  FACsort流式细胞仪(美国BD公司）、飞鸽TD2SO-2H离心机（上海安亭公司）、SW-CJ-1FD洁净工作台（苏净安泰公司）等。

1.4实验方法1.4.1阳虚大鼠模型的创建   搭配SD大鼠，每只老鼠每天按照3mg/100g体重标准展开大腿外侧肌肉注射AHP，倒数5天。大鼠经常出现背部凸起、身体蜷曲、四肢尾冻、蜷缩在一起、神情疲乏、反应僵硬、被毛质地、暗淡无光、身体虚弱、食欲减退、不耐低温、精神萎靡、毛发开裂等虚损症状[1]。根据中医八钢辩证之阳虚证，方剂参照标准[2]，类似于“阳虚”状态，解释此次试验所创建的阳虚大鼠动物模型科顺利模型。

 1.4.2实验动物分组　　将创建好的阳虚模型大鼠按随机数字表格随机分组，创建好的阳虚模型大鼠未予介入视作阳性空白对照组(A两组)，足三里、肾俞保守灸两组(B两组)，灵龟八法进穴灸两组(C两组)，灵龟八法进穴灸融合足三里、肾俞保守灸两组(D两组)，长时间大鼠视作阴性空白对照组(E两组)，共5两组，每组10只，雌雄分养。1.4.3化疗方法　　B、C、D两组大鼠每天每穴保守灸15分钟，左右交错展开，倒数2周。灵龟八法开穴法依据《子午流注与灵龟八法临床应用于盘》(魏晋丰主编，山西科学技术出版社，2010年10月，第一版)简易法选穴。A、E两组大鼠只捕捉，不做到化疗。

　　穴位定位：“脚(后)三里”穴(双)，以定坐落于后肢胫骨细隆外膝至踝间上1/5一处[3]；“肾俞”穴，定位，首先用手触碰到大鼠背部脊柱及两旁的肋骨，在肋骨完结的水平，定位第十二胸椎，然后往下数二个棘突，左右旁开1Omm(同身寸，约为人体的1/10)即为“肾俞”穴[4]。灵龟八法开穴所须要其它穴位定位参照李辞蓉等编著的《大鼠针灸穴位图谱的研制》。1.5仔细观察指标及检测方法1.5.1血液标本 使用心脏采血法搜集实验大鼠血液2ml较慢摆放在EDTA抗凝管中，以防止收集的标本再次发生发炎和炎症现象。

将搜集的血液放进离心机，展开3000并转每分钟离心10分钟，并所取上清液置放1.5mlEP管中，                  标记后放进-20℃冰箱中留存。在离心后的血液溶解重新加入3ml1×红细胞降解液，摇匀后静置15分钟。放进离心机展开1500并转每分钟离心5分钟，弃去上清液。次操作者须要反复两次。

1.5.2细胞标本（1）搜集培养液于流式管中，此时的培养液中有少量漂浮细胞。（2）六孔板中的细胞用PBS洗净一次，重新加入1ml0.25%胰酶消化细胞，待细胞变圆且有部分细胞                  漂浮，即重新加入PBS缓冲液中止消化。用移液枪用力吹打细胞，使细胞漂浮。

搜集于流式管中，                  展开每分钟1500并转离心5分钟，之后弃上清。（3）重新加入3ml4℃预冷的PBS缓冲液中新的漂浮细胞，1500并转/分钟离心5分钟，弃上清。（4）溶解重新加入100μl4℃预冷的PBS轻覆细胞。（5）重新加入荧光标记的一外用2μl，混匀后于37℃培养箱中孵育40分钟。

（6）每分钟1500并转离心5分钟，弃上清。（7）重新加入3mlPB轻覆细胞，1500并转离心5分钟，弃上清。（8）溶解重新加入100μl预冷的PBS，轻覆细胞。（9）重新加入荧光二外用2μl，混匀后于37℃培养箱中孵育40分钟。

（10）每分钟1500并转离心5分钟弃上清，重新加入3mlPBS浸一次，重新加入100μlPBS轻覆。样品上                       机，PI地下通道（FL2）检测红色荧光。1.6统计学方法　　对各组计量资料展开方差分析，组间两两较为使用Lsd-t检验。以上统计分析运用SPSS19.0统计资料软件已完成。

高希言等[111]搭配D-半乳糖导致亚急性凋亡小鼠为实验模型，随机分成艾灸督脉“大椎”“命门”“百不会”穴两组，空白对照组，与非经非穴部位不作对照组，仔细观察各组凋亡小鼠的胸腺和脾脏指数、T细胞亚群中CD3+百分率、CD4+百分率、CD8+百分率以及CD4+／CD8+比值、可溶性IL-2受体含量。找到各建模组小鼠免疫系统功能较长时间小鼠减少(PO.O1)。

督脉穴两组小鼠的胸腺、脾脏指数和免疫系统功能强化，与模型组比起差异有十分显著性意义(PO.01)。李津利【222】等，运用心俞、足三里、三阴交等主穴融合患者临床症状配以适当辅穴，对HIV/AIDS患者展开艾灸化疗。

结果表明经5个疗程化疗后，患者力弱、痉挛、皮疹、淋巴结肿胀、腹痛、呕吐、纳呆等症状皆有提高。但是化疗前后T淋巴细胞亚群测试结果经统计学处置，差异无显著性意义(P0.05)。解释灸法化疗HIV/AIDS患者有一定疗效。什金花【333】等，对缓解期重复呼吸道病毒感染(RRTI)患儿用针灸融合艾灸的方法展开化疗，疗程3个月，观察期为1年。

找到试验组化疗后CD3+、CD4+、IgA、IgG水平较化疗前提升，对照组化疗后CD3+、CD4十、CD8+、CD4十／CD8+、IgA、IgG水平较化疗前提升，差异皆有统计学意义(P0.05或P0.01)。对照组化疗后CD3+、CD4+、CD8+、CD4+／CD8+、IgG提高高于试验组，差异有统计学意义(P0.05或P0．01)。不仅灸法可以提升机体免疫力，有所不同的灸法也有这有所不同的影响。翟道荡等【444】艾炷必要灸荷瘤小鼠关元、大椎和中院穴，仔细观察对下丘脑、垂体、肾上腺和血浆β-END含量的影响。

找到艾灸有可能通过增进垂体β-END的获释，提升血浆β-END浓度，从而充分发挥免疫调节等起到。张彤【555】等，用艾条雀啄灸“翳风”穴化疗青少年面瘫，灸清领一个月后机体CD3及CD4显著增高，CD4/CD8比值明显改善。唐照耀【666】等用艾条间接灸肾俞穴仔细观察其对佐剂性关节炎大鼠炎症和免疫系统功能的影响。

通过淋巴细胞功能侧定指出艾条灸清领两组大鼠对ConA.IL-2诱导的脾细胞增殖反应显著低长时间组和致炎两组(P0.01)，指出机体免疫系统接收者强化和免疫系统功能提升。王文莉【777】等用麦粒灸可以提升脾虚泄患者红细胞C3b受体花环亲率、减少红细胞免疫系统复合物花环亲率、CD4值和血清SIgA含量。灸法对IL-2的影响研究 李丽红【888】等将60只SD级洗手大鼠机分成青年对照组、凋亡模型组、艾灸组、中药组、艾灸特中药组。皮下注射D-半乳糖创建凋亡大鼠模型。

化疗40天后找到凋亡模型组大鼠肝血清IL-2含量与青年对照组比起显著增加（P0.05)。与凋亡模型组比起外周血IL-2含量明显增加（P0.05)。解释艾灸与中药均可提升大鼠外周血IL-2含量，从而超过强化免疫力的起到。

唐照耀【999】等，仔细观察艾灸对佐剂性关节炎大鼠抗炎消肿性起到，找到艾灸大鼠足三里，肾俞穴可以减少大鼠TNF,NO,IL-1含量，提升IL-2水平。除了IL-1外，其余指标皆与模型组具有明显的差异性（P0.05)。

解释艾灸足三里，肾俞穴可以调整机体免疫系统失调及自由基新陈代谢流失。某种程度，陈晓莉【1010】等，通过观察麦粒灸对佐剂性关节炎大鼠免疫系统功能的影响，找到结果模型组大鼠腹腔巨噬细胞IL-1,IL-6的活性比长时间大鼠显著增高(P0.O1)。

麦粒灸两组大鼠IL-1,IL-6活性较模型组比显著上升(P0.05)。麦粒灸加去肾上腺两组IL-1,IL-6活性未见显著变化(P0.05).假手术两组IL-1活性近于明显减少(P0.O1)。IL-6比模型组显著为较低(P0.05)。

模型组大鼠脾脏IL-2活性减少(P0.05)，麦粒灸化疗后可使IL-2活性近于明显增高(P0.O1)，麦粒灸加去肾上腺两组IL-2活性与麦粒灸组及假手术组比(P0.05)，但与模型组比无显著性差异(P0.05)。假手术两组IL-2活性亦明显提高(P0.O1)，而与长时间组无差异。得出结论，麦粒灸可抑制AA大鼠IL-1,IL-6活性。

切除肾上腺后则麦粒灸无法减少IL-1,IL-6活性;麦粒灸可明显提高IL-2活性，切除肾上腺后麦粒灸则对IL-2活性无显著影响;麦粒灸对AA细胞免疫功能的调整与下丘脑一垂体一肾上腺的原始有关。选穴依据 足三里适应症众多，临床应用于普遍。足三里又被称作下陵，鬼妖，中俞髎是胃经的下合穴，归属于“四总穴”知名的“回阳九针”之一。

此穴始所撰《内经》，仅有在《灵枢》中有关其主治运用的记述即约15处之多。随着针灸学的发展，其功效渐渐非常丰富，历代对其主治记述日广，《古法新解不会元针灸学》曰：“此穴医治万端，有白术之强劲，有桂所附之热，有参茸之功，有硝黄之力”，故而沦为临床常用要穴，历年来就被尊崇为补虚培元之要穴。孙思邈的《千金要方》曰：“若要福，三里常不干”。《针灸资生经》:“若要福、丹田三里未曾腊。

”《灵枢·热病》曰:“中有寒，所取三里”。《灵枢·四时气篇》:“着痹不去，幸寒深感，卒所取其三里。”华佗云:“五劳输掉髯，七伤虚乏，大小人冷，均徵三里。”《针灸真髓》云:“三里饲先天后天之气。

”关于此类的阐述在我们诸多古代医籍中比比皆是，解释足三里历代就被尊崇为健脾补虚之要穴。它不仅可以起到疾病的反应点协助临床，也是化疗多种疾病的主穴，要穴。

它对于机体的调节作用是双向的，“过于过”可泻之，“不及”可补之。 中医学指出,肾藏精,生髓。肾俞穴系肾在背部之输穴，坐落于十四椎之旁，穴将近肾脏而内应肾，是肾气转输、静脉注射之所，为清领肾之要穴，有益肾填腰、固精补虚、壮阳利尿、健脑明目之功，临床常用于化疗由肾虚(还包括肾阳虚)引发的各种病症。《素问·阴阳应象大论》曰:“肾生骨髓”，是因髓乃是肾之精气所化，肾主骨，髓饲骨。

所以，有人明确提出了“肾气-免疫系统”系统的概念[86].也正是基于现代医学研究找到免疫系统活性细胞的主要组成部分，由其是T淋巴细胞，正是由骨骼的肝脏细胞派生而出。【80]。

   综上所述，足三里穴是阳明胃经之合穴，有调脾胃、饲气血、扶正壮阳之功，可以考虑到“后天之本”;肾俞穴是脏腑气血汇集的背脑穴，能补肾气、益阴阳、强劲腰健骨，考虑到“先天之本”。两者专设，相辅相成，先天于后天顾及，固本培元，故本实验使用此两穴。灵龟八法与机体免疫系统功能的关系灵龟八法      模型评价 流式细胞法术的自由选择   在临床上，外周血CD4+,CD8+T淋巴细胞的意味著计数对于评价患者免疫系统功能和监测免疫系统抑制剂的用于具有根本性的意义。本实验对大鼠外周血T淋巴细胞亚群CD4+/CD8+检测方法，搭配的是流式细胞法术。

流式细胞法术(FCM)是用一种在功能水平层面对单个细胞或生物粒子展开定量分析的检测手段。是细胞生物学、分子生物学、激光技术、电子计算机技术等学科的综合结晶。

具备速度快、敏感性低、准确性好等优点[1.2]。   用流式细胞仪检测由于其影响因素较多，很多因素都有可能造成结果的偏差，所以在实际操作中一些操作者细节必需加以留意，以获得更为平稳可信，重复性好的结果[121]。

在实际操作中不应留意以下几点:   1)标本的留取:对抗凝剂的自由选择十分最重要，这一环节必要关系到采行的标本的质量。使用的抗凝剂是1%肝素钠注射液。抗凝剂的计量要与采行的血液的计量比例必要，以确保血液能充份抗凝同时确保血液不被过度溶解。

因此有适当在收集血液之前，通过实实验的经验，提早计算出来好肝素用量的范围。在展开完了采血工作后一定要将标本充份混匀，以确保其充份抗凝。   2)标本的检验:标本不应在采血后6小时内展开检测。

无法及时检验，不应及时留存于4℃冰箱中，否则则不易经常出现发炎现象。　　　试剂的质控:用于试剂前须要详尽读者试剂的解释说道，操作者时一定要严苛按说明书继续执行。在测量时还要时刻留意FS,SS二维散点图，仔细观察白细胞否较好的分成三群(淋巴细胞，粒细胞，单核细胞)，如分群很差提醒前期处置有问题，不应找寻原因，适当时及时替换试剂。

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